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Nanopore宏基因組測序直接從臨床呼吸道樣品檢測流

英國科學家在2020年1月發表的最新文獻中使用Nanopore宏基因組測序從40份流感病人鼻咽拭子樣品中檢測到1份樣品中含有冠狀病毒。這一份樣品屬于流感和冠狀病毒的復合感染。
張文宏醫生說:“流感年年有,我們只是不知道下一次全球大爆發的時間,一定會來的。”為什么說一定會來的?如何更有效的檢測流感病毒是醫學和科研工作者面臨的一大挑戰。病毒宏基因組測序技術為流感病毒的診斷提供了可能性,該技術不僅可以分析病毒的傳播、進化和耐藥性,還可以檢測到其他病毒,如冠狀病毒。下方文章詳細介紹了應用Nanopore進行病毒宏基因組研究的方法。


研究背景

流感病毒是一種含有8段主要序列基因組大小為16Kb的RNA病毒,具有高致病性、變異能力強、人畜共患病和流行潛力大的特點。季節性流感每年在全球范圍內造成65萬人死亡,僅H3N2變異就導致美國每年35,000人死亡。老年人、嬰兒、幼兒、孕婦、潛在肺病患者和免疫功能低下者為易感人群。
目前流感病毒的臨床診斷實驗主要是呼吸道樣本抗原的免疫檢測(POCT)和核酸的PCR檢測。前者靈敏度低但速度快,后者靈敏度高但是耗時;并且大多診斷機構給的都是定性結果。因此快速、靈敏度高可以定量或者半定量的檢測技術的開發顯得十分重要。
Nanopore測序技術是一種便攜式實時長讀長單分子測序技術,并且在一系列病毒檢測中獲得成功。該研究旨在使用基于Nanopore的宏基因組測序檢測流感病毒。



發表雜志:Journal of Clinical Microbiology
發表日期:2020.01
影響因子:4.959

宏基因組測序實驗流程的優化




對個體臨床樣品進行Nanopore宏基因組測序的流程



材料和方法

樣品來自于英國東南部的牛津大學醫院的臨床微生物學實驗室剩余樣品。是使用CDC網站上描述的標準方法采集的鼻咽拭子樣品。在臨床實驗室使用基于PCR技術的GeneXpert對流感病毒A和B以及RSV進行檢測。
為了進行方法評估,將樣品分成四類,陽性池、陰性池、陽性個體和陰性個體。將19個臨床診斷實驗室檢測出流感病毒A陽性的咽拭子樣本混合成陽性池,以提供足夠大的樣本來評估重復性;分別混合24、38和38個流感病毒陰性的咽拭子樣本構成3個陰性池(圖1);陽性個體40個(35個喉拭子和5個鼻拭子)樣品,都是流感病毒A或B陽性的個體;陰性個體10個,都是流感病毒陰性的咽拭子樣品。
使用qRT-PCR方法檢測陽性池中流感病毒A和Hazara病毒的滴度。
將每個陰性池等分成5份,分別加入0,102,103,104和106的流感病毒A;同時每個樣品加入每毫升104個拷貝的在臨床樣品中不會出現的外援Hazara病毒,作為內部陽性對照(圖1)。
 

圖1 Nanopore宏基因組測序的實驗步驟(A)和樣品混池的方法(B)


在建立詳細描述的方案之前,評估了兩個可能優化的實驗步驟,第一是病毒純化的方法,離心法與過濾法;第二是優化cDNA合成時間的方法。
最后將該測序方法用于白鼬感染H1N1pdm09鼻腔洗液的樣品,分別選取3個獨立的白鼬個體,感染H1N1pdm09前3天和感染后第1天,第3天和第5天的樣品。


研究結果

1.提高拭子病毒reads比例優化方法

常規宏基因組方法:分別對5個陽性樣品和5個陰性樣品(均添加了104 genome copies/ml Hazara病毒作為內部陽性對照),使用常規方法對核酸進行提取,采用不依賴序列的單引物擴增(SISPA)后進行Nanopore測序,獲取的數據大多是細菌的序列,病毒的序列較少(圖S1)。


圖S1 常規方法和過濾方法檢測到的病毒reads數的比較
 
 
優化方法:

(1)在核酸提取之前,將10個樣品分別通過0.4μm的過濾器,病毒reads可以增加幾個數量級(圖S1)。
(2)樣品進行快速離心(16,000 g for 2 min),取上清液進行提取,可以去除大部分細菌和人體細胞。過濾和離心,對流感病毒和Hazara病毒的富集效果相似(圖S2)。由于離心方法更簡單,成本更低,所以選擇離心進行后續實驗。
 



圖S2 過濾和離心檢測的流感病毒A和Hazara病毒reads數的比較
 

2.縮短cDNA合成時間優化方法

常規宏基因組方法:用隨機標記引物逆轉錄成cDNA,隨后進行SISPA擴增,需要的時間分別為1小時和3小時45分鐘。
優化方法:將逆轉錄酶從SuperScript III升級到SuperScript IV,將孵育時間縮短到10分鐘(比常規處理時間減少50分鐘),并將PCR擴展時間從5分鐘縮短到2分鐘(比常規處理時間減少1小時30分鐘)。優化的方法檢測病毒效果相同(圖S3),但可以減少2小時20分鐘,最終選擇優化的方法進行后續實驗,整個實驗過程需要的時間約8小時。


圖S3 常規方法和縮短處理時間方法檢測的流感病毒A和Hazara病毒reads數的比較


3.Nanopore測序對Hazara病毒的檢測


經過SISPA擴增后,檢測cDNA總濃度,結果顯示,1和2號池含有數量相當的背景材料,3號池包含更多的背景材料(圖2A)。測序結果顯示,1號和2號池中檢測到的Hazara病毒reads比率一致,而在3號池中檢測到的Hazara病毒reads比率較低,進一步證實更多的非病毒RNA被引入(圖2B)。

圖2  3種混池中不同滴度樣品檢測的cDNA和病毒reads數結果

 
4.Nanopore測序對混合樣品流感病毒的檢測


比對到流感病毒A基因組的reads比率,隨稀釋濃度的降低而下降。在流感病毒滴度<103 copies /ml時,檢測到的流感病毒reads比率不同(圖2B),表明檢測限為102-103 influenza virus copies/ml。
 

5.從混合樣品檢測流感病毒基因組


流感病毒A滴度為10copies/ml時,基因組每個片段的覆蓋率均大于99.3%(圖3A),滴度為104 copies/ml,1號和2號池,每個片段覆蓋率為90.3%。滴度<104 copies/ml,每個片段的覆蓋度變化較大,但滴度為103 copies/ml時,仍然2/3的混合樣品可以檢測到H3N2(表1)。


圖3 Nanopore測序檢測混合樣本中流感病毒和Hazara病毒基因組的覆蓋情況

 
 
表1 Nanopore測序檢測混合樣本中流感病毒A和Hazara病毒基因組reads數概述


6.從個體臨床樣本中檢測流感病毒

分別對臨床診斷的40個流感病毒陽性樣品和10個陰性樣本進行Nanopore宏基因組測序,12個樣品混合測一張芯片,每個臨床樣本產生的總reads為1.0*105-2.4*106(中位數,3.8*105 reads)。
CT<30(CT值指每個樣品反應管內熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數)時,27個樣本可以檢測到流感病毒A/B,檢測的流感病毒reads數范圍為6-274,955。在CT>30時,6/13的樣本檢測到流感病毒(reads數范圍為6-92,057)(圖4)。CT值為36.8時,檢測到部分流感病毒。10個陰性樣本沒有檢測到流感病毒。基于上述結果,敏感性為83%,特異性為100%。

圖4 在一定CT值范圍內,個體樣品Nanopore測序獲得的流感病毒總數和比例

 

7.Nanopore和Illumina測序的比較

從病毒效價范圍內選擇了15個樣本,使用Illumina Miseq平臺重新測序。結果顯示,兩種測序技術檢測到的流感病毒reads比例相似,大部分一致性序列的一致性為100%,除了一個樣本有7個核苷酸差異(一致性為99.94%)。
 


8.流感病毒系統進化樹

使用HA基因的一致性序列構建系統進化樹(圖5),結果與流感季節發生的地理環境分布一致。

圖5 Nanopore和Illumina測序獲得的流感病毒HA基因的系統發育樹

 

10.其他RNA病毒的檢測

在50個臨床樣本中,檢測到了其他RNA病毒,其中給一個樣品中有109條reads比對到人冠狀病毒,且有>1.5*104流感病毒reads,表明屬于合并感染。此外,從流感病毒陰性樣本中檢測到>4.0*104人偏肺病毒reads(99.8%的覆蓋率)。
 


11.動物模型研究

最后將該測序方法用于3個獨立的感染H1N1pdm09白鼬個體樣品,測試宏基因組測序在感染流感病毒A的不同時間的重現性。結果表明在每個時間點檢測到的病毒reads比例與病毒滴度一致(圖6)。而且在感染后第2、3和5天,使用Nanopore測序和Illumina測序產生的一致序列一致性為100%。
圖6 感染流感病毒A的3只實驗室白鼬在不同時間的流感病毒檢測結果
 


總結

本研究首次成功地將Nanopore宏基因組測序直接應用于臨床呼吸道樣本檢測流感病毒。該方法具有良好的特異性,敏感性因病毒滴度而異。優化的方法可以減少人類和細菌核酸,縮短了從樣品到數據的時間。該方法可以進一步優化和驗證,以提高流感病毒的敏感性,識別其他RNA病毒,檢測耐藥突變,并洞察準種多樣性。同時也表明Nanopore平臺有望用于流感病毒和其他呼吸道病毒的診斷和遺傳分析。
 
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